多组学联合分析确定长期 COVID 的临床表型和预测生物标志物

国内代生求子

编译：微科盟文言，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

新冠肺炎（COVID-19）后遗症（PASC），也称为长期新冠（COVID），常常会出现乏力、睡眠障碍、困惑、呼吸不畅等症状，也伴随着多系统的不良副作用。我们从117个参与者在感染急性期间和6个月后的康复期获取了血浆样本，全面评估和分析了血浆种细胞因子、蛋白质组和代谢组在这一过程中的变化。网络分析揭示了康复期间的持续炎症反应、血小板脱颗粒化和细胞激活，过程中伴随着精氨酸生物合成、甲硫氨酸代谢和牛磺酸代谢以及三羧酸(TCA)循环过程的调控紊乱。

此外，我们开发了一个由20个分子（主要参与调节T细胞耗竭和能量代谢）组成的预后模型，这一模型可以在出院时可靠地预测新冠急性期感染后的不良临床结果，准确率高达83%，曲线下面积(AUC)为0.96。我们的研究揭示了康复期与急性感染的生物过程存在极大区别，并支持为长期新冠患者开发特定的治疗方法和生物标志物。

图文摘要

论文ID

原名：Sequentialmulti-omicsanalysisidentifiesclinicalphenotypesandpredictivebiomarkersforlongCOVID

译名：连续多组学联合分析确定长期COVID的临床表型和预测生物标志物

期刊：CellReportsMedicine

IF：14.3

发表时间：2025年10月

通讯作者：

通讯作者单位：加拿大阿尔伯塔大学

实验设计

结果

参与者特征

本研究纳入117名参与者，这些患者是从至在指定的新冠病房(n=97)和重症监护室(n评估20)收治，其中重复采血的平均时间为6.3（四分位距范围[IQR]:6.7.1）个月（图1A）。在重复采集样本期间，捕捉了患者的PASC症状学、健康相关的生活质量评分和临床结果，使用自我报告的问卷形式和他们的电子病例进行了详细的回顾（表S1）。报告指出PASC最常见的症状是疲劳（66个受试者，比例56.4%）、全身无力（49个受试者，比例41.9%）、呼吸短促（SOB，47个受试者，比例40.2%）、认知障碍（39个受试者，比例33.3%）和情绪障碍（39个受试者，比例33.3%，图1B）。为了进行比较，根据症状负担将PASC患者分为三组：康复组（无PASC症状，n=30）、轻度组（3个症状，n=32）和重度组（3个症状，n=55）（表1；表S2）。总体队列的特点是中位年龄为62岁（IQR：73岁），其中66名为男性（56.4%），糖尿病患病率较高（49人；41.9%），高血压患病率为62人（53.0%）。除吸烟情况外，PASC患者三组之间的临床特征相似，其中重度组中当前或以前吸烟者比例较高（31人；56.4%，p=0.005）。相比之下，生活质量简表评分（SF-健康相关的生活质量评分）（康复组为113[IQR：1115]，轻度组为96[IQR：106]，重度组为80[IQR：90]，）和EuroQol视觉模拟量表评分（EQ-VAS）（康复组为90[IQR：92]，轻度组为83[IQR：90]，重度组为63[IQR：76]，）与PASC严重程度密切相关（图1C）。此外，PASC重度组在急性感染出院后出现不良结局（全因死亡或再次住院）的人数比例较大（p=0.图1D；表S2）。因此，我们的研究结局也表明，随着患者从急性感染过渡到康复期，他们仍然持续存在症状负担重的情况，同时也面临不良结局的风险。

图1.新冠后急性期继发症状（PASC）症状和参与者的健康相关生活质量

（A）研究设计和分析概述。

（B）康复期PASC症状的患病率；条形图表示自我报告症状的百分比。

（C）康复期PASC严重程度组中的总SF-12分数和EuroQuol视觉模拟量标尺（EQ-VAS）。星号表示Mann-WhitneyU检验与Benjamini-Hochberg校正后的统计学显著性，用于衡量每个生活质量指标的严重程度组之间的差异，如下所示：：*，**，***，****。

（D）康复期PASC严重程度与出院后不良临床结果（包括全因死亡和重新住院）间关联性。Logrankp=0.03。

表1.临床基线特征

简写：BMI（bodymassindex），体重指数；CXR(chestX-ray)，胸部X光片；COPD(chronicobstructivepulmonarydisease)，慢性阻塞性肺病；CKD(chronickidneydisease)，慢性肾脏疾病；CVD(cardiovasculardisease)，心血管疾病（包括既往心肌梗死、冠状动脉疾病、心力衰竭、心房和室性心律失常病史）

急性感染与康复期细胞因子、蛋白质组和代谢组的变化情况

对急性感染和康复期患者的血浆分子特征进行细胞因子、蛋白质组学和代谢组学分析，以确定其随时间变化的规律。其中，检测到47种细胞因子、274种蛋白质和635种代谢物（表S2）。随后，对所有样品进行了主成分分析（PCA），结果显示，与急性感染患者相比，康复期的患者分子谱发生了变化，两者均与健康对照组不同（图2A）。急性感染组和健康对照组比较时，231个分子发生显著改变，包括24个细胞因子、63个蛋白质和144个代谢物（图2B；表S3）。此外，急性感染组和康复组对比，也检测到157个差异表达分子（DEMs），包括8个细胞因子、34个蛋白质和115个代谢物（图2C；表S3）。最后，在康复组和健康对照组之间，鉴定出219个DEMs，包括9个细胞因子、31个蛋白质和169个代谢物（图2D；表S3）。

在热图中显示了具有最显著p值的前100个分子的变化轨迹，相对于健康对照组，展示了急性感染和康复期患者中的变化情况（图2E）。在康复期间，大部分分子恢复到与健康对照组相当的水平。然而，这些分子中的一些仍然发生改变，可能与PASC的发展有关。具体来说，血栓素蛋白-1（TSP-1）逐渐增加，它是TGF-b（一种重要的创伤愈合、血管生成和组织纤维化调节因子）的重要激活因子，在健康对照组到急性感染和康复期中逐渐增加（图2F）。相比之下，相对于健康对照组，谷氨酰胺在急性感染和康复期仍然较低，这代表了COVID-19的代谢特征，与更严重的疾病程度有关。此外，血清素的水平在急性感染和康复期仍然持续升高，而且在康复期水平更高，可能与血小板脱颗粒的持续活化有关。同样，急性感染期可溶性CD40配体升高，并且在康复期继续上升（图2F），这可能反映了病毒介导的炎症的持续存在，因为在SARS-CoV-2感染后数月内已经证明有强有力的T细胞反应。因此，我们的结果揭示了康复期存在多条通路的持续改变，这些变化具有病理学特征，其中以代谢变化为主导的模式十分明显。

图2.与急性期和康复期相关的差异表达分子（DEMs）

（A）利用蛋白质组学、代谢组学和细胞因子（数据采用log10转换）进行的主成分分析（PCA）表明，主成分1和主成分2分别捕获了参与者之间30.2%和7.5%的差异。

（B）比较急性感染与健康对照组间DEMs差异的火山图；水平虚线表示经过校正的p值阈值（0.05），两条垂直虚线表示差异倍数阈值（1.5）。橙色点表示差异表达的细胞因子，紫色点表示差异表达的代谢物，绿色点表示差异表达的蛋白质。

（C）比较康复期与急性感染期组间DEMs差异的火山图。（D）比较康复期与健康对照组间DEMs差异的火山图。

（E）热图显示健康对照、急性期和康复期组间的p值最显著的前100个分子（使用经过log10转化的数据进行ANOVA计算）。

（F）箱线图显示血小板反应蛋白-谷氨酰胺、血清素和sCD40L的水平。星号表示Mann-WhitneyU检验与Benjamini-Hochberg校正后的统计学显著性，用于衡量每个生活质量指标的严重程度组之间的差异，如下所示：：*，**，***，****。

急性感染和康复期不同的通路变化

对于急性感染组和健康对照组之间的差异表达基因进行的综合通路分析鉴定出了与免疫细胞刺激以及IL-IL-TNF和Toll样受体3信号激活相关的通路（图3A和3B；表S4）。值得注意的是，与急性感染期间的免疫细胞计数和实验室疾病标志物强烈相关的蛋白质包括血小板脱颗粒、急性期反应和补体系统级联反应（图S1；表S5）。P-选择素、TSP-纤连蛋白和凝血因子XIII水平与血小板和淋巴细胞计数呈正相关，这表明血小板与急性SARS-CoV-2感染中的适应性免疫之间存在密切的相互作用。此外，C-反应蛋白和脂多糖结合蛋白与高敏感性肌钙蛋白呈正相关，可能是炎症引起的心脏损伤的潜在标志。此外，在急性感染期间，代谢通路的变化包括精氨酸生物合成、谷氨酸代谢和鞘脂代谢，与先前的多组学研究结果一致（图3C；表S6）。

为了阐明长期COVID的发病机制并确定治疗靶点，我们接下来研究了急性感染后6个月发生的分子变化。我们的发现显示，与健康个体相比，在康复期中免疫活化显著且持续，表现为急性期反应、IL-TNF和IL-6途径的激活，类似于急性感染阶段（图3D和3E；表S4）。此外，在康复期中发现了多个关键代谢产物失调，其中包括与葡萄糖代谢有关的酮戊二酸、鸟氨酸、精胺和尿囊素，据推测与细胞途径的激活（如sirtuin6和葡萄糖-磷酸脱氢酶）有关（图S2A）。与康复期患者中急性感染期间的研究结果一致，我们发现康复期中血小板脱颗粒和血液凝固仍然失调。此外，康复期时组学特征与细胞迁移和生长因子信号通路的激活相关，表现为血小板内皮细胞黏附分子1（也称为CD31）、血栓素蛋白-成纤维细胞生长因子2和血管内皮生长因子A的水平升高（图S2B）。

虽然康复期的分子特征与急性感染相似，但急性期反应、IL-1和IL-6信号通路的程度明显下调，而肝X受体信号通路上调，表明向消退和修复方向转变（图S3；表S4）。此外，精氨酸生物合成、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及TCA循环在急性期和康复期之间有差异（表S6）。与急性感染相比，涉及TCA循环的代谢产物，如丙酮酸、苹果酸、顺式乌头酸和酮戊二酸，在康复期进一步升高。令人吃惊的是，即使在没有慢性COVID症状报告且功能恢复到COVID-19前状态的个体（n=30）中，这些通路的紊乱仍然存在，表明尽管症状得到缓解，但潜在的病理过程仍然持续存在（图S4；表S3）。因此，即使看起来已经康复的个体，康复期期间持续的炎症、细胞信号和代谢通路的失调可能会导致未来并发症和医疗资源利用的增加。

图3.急性感染期和康复期中调控失调的通路

(A)对比健康对照组，基于Metascape的急性COVID-19中差异表达的蛋白质和细胞因子的富集基因本体论(GO)术语，按照p值进行颜色分类。

(B)基于IngenuityPathwayAnalysis(IPA)，急性COVID-19中分子和功能的顶级调控效应。

(C)急性COVID-19中代谢改变相关的通路，与健康对照组进行对比。通路影响是基于通路拓扑的改变代谢物的重要性之和；-log(P)是基于组间浓度差异进行的定量通路富集分析的检验统计量。显著受影响的通路在虚线以上（且-log(P)20）。

(D)对比健康对照组，基于Metascape的康复期中差异表达的蛋白质和细胞因子的富集GO术语，按照p值进行颜色分类。

(E)基于IngenuityPathwayAnalysis(IPA)，康复期中分子和功能的顶级调控效应。

(F)康复期中代谢改变相关的通路，与健康对照组进行对比。

蛋白质组和代谢组特征与临床参数的关联分析

图4.PASC症状与康复期中的分子特征以及生活质量的关联

(A)在考虑年龄、性别、糖尿病、急性COVID-19治疗（地塞米松、抗生素、托珠单抗、瑞德西韦）、世界卫生组织量表和疫苗接种状态的情况下，绘制了与康复期与健康对照组之间的多组学谱中差异表达分子（DEMs）相关的长期COVID症状和不良结局的热图，至少具有三个显著关联，。

(B)基于康复人群与健康对照组之间的多组学特征与健康相关生活质量指数（总分SF12和EQ-VAS量表）之间的显著关联，调整了年龄、性别、糖尿病、急性COVID-19治疗（地塞米松、抗生素、托珠单抗、瑞德西韦）、世界卫生组织顺序量表和接种情况，生成的热图。

无监督聚类模型用来识别康复期的三种不同表型

接下来，我们基于细胞因子、蛋白质和代谢物浓度在急性期和康复期之间的变化，对个体进行了无监督聚类分析。首先，我们采用主成分分析（PCA）作为降维方法，然后应用k-means算法（图S6A）。然而，通过轮廓系数确定聚类效果不够理想，所以我们采用了自编码器非线性方法（图S6B）。在自编码器上进行k-means聚类，基于分子相似性将个体分为了三个表型上有明显差异的簇（表S7）。与我们的PCA图一致，基于分子特征鉴定的簇与PASC严重程度分类（基于症状数量）不一致，每个严重程度组的个体在A到C簇中均匀分布（图S6C）。大多数个体被A簇聚类（n=48.7%），其分子特点无明显偏离，并且具有最少的确定的PASC风险因素。相比之下，B簇以甘油三酯和有机酸为主要特征（图5A），而C簇显示出更为异质的细胞因子、蛋白质和代谢物组成（图5B）。此外，与B簇相比，C簇中女性比例更高，并且更频繁报告失眠、心悸、气短、全身乏力和疲劳等症状（图5C）。有趣的是，基于C簇中的分子鉴定出的顶级网络在HIF-1α通路中富集，该通路调节细胞对缺氧和代谢适应的反应，并表现出性别差异的激活，这为PASC流行病学中观察到的性别差异提供了可能的分子基础（图5D：表S4）。重要的是，C簇中血浆中肠道微生物产生的代谢产物三甲胺-N-氧化物（TMAO）和苯乙酰谷氨酰胺的水平增高与症状恶化和不良预后相关，这与长期COVID患者中持续的微生物失调与心血管疾病相关联的情况一致（图5E）。因此，我们使用无监督聚类的无偏方法突出了三个临床上有明显特点的长期COVID患者群体，具有独特的生物标志物和症状学特征。

图5.基于急性感染和康复期之间分子标志物的时间变化的无监督聚类分析

(A)在B类簇中≧65%偏差的分子特征。

(B)在C类簇中≧65%偏差的分子特征。

(C)不同疾病簇中的临床特征和PASC症状的差异。使用修正的Yates'卡方检验计算p值。

(D)基于IngenuityPathwayAnalysis(Qiagen)对C类簇中分子标志物进行的网络分析。

(E)与健康对照组相比，按临床结局（有事件和无事件）和PASC严重程度（康复、轻度和重度）分层的三甲胺N-氧化物（TMAO）和苯乙酰谷氨酰胺水平。星号表示Mann-WhitneyU检验和Benjamini-Hochberg校正在每个分子的不同组之间的统计显著性：，，，**。

康复期不良临床结局相关的生物标志物

在出院后的中位数持续时间为17.4（14.18.8）个月内，36名受试者（30.8%）达到了全因死亡或再次住院。为揭示与康复期不良预后相关的分子，我们根据重复采样时的多组学特征对结果进行分类。使用多重细胞因子、蛋白质和代谢物开发了机器学习模型。通过5倍交叉验证使用线性分类器进行验证，以预测急性感染出院后不良事件的发生率（图6A）。受试者被随机分成训练集（90%）用于变量选择和模型开发，而剩下的10%被用作验证集。从训练集中，首选了最低的20个变量的组合，包括七个细胞因子和13个代谢物，达到了0.96的曲线下面积（AUC）（图6B：表S8）。相比于综合的多组学数据集，这个最低选定组合在准确性（0.83比0.75）、召回率（1.00比0.40）和F1得分（0.83比0.57）方面表现更好，但精确度略有降低（0.71比1.图6C）。当我们在验证集上测试模型时，所有发生事件的个体都被该组合正确预测到（图6D）。然而，两个无事件的幸存者被错误地预测为会发生事件，他们是69岁和77岁的高龄女性。网络分析显示，我们的最低预测组合中，精氨酸和牛磺酸代谢物表达下调，伴随着保护性细胞因子（包括白介素22[IL-22]和集落刺激因子3[CSF3]）的减少以及促炎细胞因子（包括白介素15[IL-15]）的上调，同时伴随白介素10（IL-10）的增加（图6E）。有趣的是，白介素27（IL-27），一种多功能细胞因子，是最能预测不良结果的最重要生物标志物。

图6.康复期不良结局的预测生物标志物

(A)使用每个单独的组学数据集、综合组学数据（细胞因子、蛋白质组学和代谢组学）以及康复期分子谱构建的预测模型的受试者工作特征曲线。

(B)最小分子组合由七个细胞因子和十三个代谢物组成，这些特征是基于康复期分子谱进行顺序特征提取选择的。

(C)使用每个单独的组学数据集、综合组学数据和最小分子组合对测试集进行分类器性能指标。

(D)预测分数图展示了最小分子组合在对测试集进行分类中的有效性。

(E)基于IPA工具的最小分子组合中包含的分子网络。

讨论

与我们队列中PASC症状负担一致，我们观察到在SARS-CoV-2感染后6个月以上存在多种已知参与病原机制的生物途径的持续失调。在康复期观察到显著的免疫激活和应激反应，以及细胞因子（如IL-1β、IL-CXCLIL-IL-8和IL-18）的上调，与长期COVID中观察到的先天性和适应性免疫细胞群体的改变一致。此外，在急性感染康复期间，血小板脱颗粒和异常血液凝血涉及的细胞因子和蛋白质进一步升高。因此，PASC患者的血浆特征是大量微血栓的存在，同时血栓形成级联蛋白和对纤溶系统的抗性增强。对COVID-19幸存者血小板的功能刺激证实了其高反应性和颗粒增多的状态。这些发现表明急性感染期间观察到的高凝状态在康复期仍然存在，突出了个体化抗凝治疗在处理长期COVID并发症中的潜在实用性。此外，我们的数据显示，康复期间细胞状态呈动态变化，包括细胞激活、迁移、增殖、信号传导和相互作用。网络分析表明表皮生长因子（EGF）信号传导途径的激活对这些细胞过程至关重要，该途径受炎症和细胞应激诱导。确实，在EGF信号传导的上调下，TGF-b的激活有助于受损血管细胞的屏障恢复和外膜细胞向产生胶原的肌成纤维细胞分化。然而，SARS-CoV-2感染后的肺纤维化与一部分参与者中异常的EGF激活相关，与受损肺功能和弥散功能降低有关。

通过全局代谢组分析，我们发现急性感染和康复期之间存在三个显著失调的主要代谢途径，包括精氨酸生物合成、半胱氨酸与甲硫氨酸代谢以及三羧酸循环。在急性SARS-CoV-2感染中，外周单核细胞和内皮细胞存在线粒体功能障碍和无法应对能量需求增加的问题。与高炎症反应和细胞因子风暴一致，在急性感染期间需要插管的患者显示出增加的能量消耗和高代谢表型。因此，持续升高的三羧酸循环代谢物可能反映出为补偿线粒体功能障碍和因慢性炎症和组织修复增强的代谢需求而增加的能量产生，这与以共同的代谢抑低状态为特征的慢性疲劳综合征形成鲜明对比。这些结果与基于血浆和外泌体分析的急性感染结果一致，因为细胞代谢途径也明显改变。与急性期相比，在康复期间，蛋氨酸途径的几种氨基酸（如L-蛋氨酸、L-半胱氨酸和α-氨基丁酸）显著减少。蛋氨酸是一种必需氨基酸，参与合成谷胱甘肽以缓解氧化应激并发挥重要的抗氧化作用。由于三羧酸循环活性和线粒体生物能量直接影响细胞能量供应，这些过程的失调可能是长期COVID中广泛出现疲劳和虚弱的高发生率的原因。类似的碳水化合物代谢紊乱也与神经退行性疾病如阿尔茨海默病的发展有关。结合在感染后数月在大脑中持续检测到SARS-CoV-2的发现，我们推测氧化损伤可能在介导与PASC相关的大脑混乱、记忆丧失、情绪障碍和晚期老化特征方面发挥关键作用。

利用培训队列中105名个体的康复多组学数据，我们开发了一个包含7种细胞因子和13种代谢物的最小组合，表现出良好的预测价值，达到了0.96的AUC，并达到了83%的准确率。在康复期个体的结果预测中，细胞因子和代谢物的卓越分类能力进一步加强了失调的炎症和代谢反应在长期COVID中的病理作用。值得注意的是，该面板中的细胞因子主要与IL-27信号通路的激活相关，如IL-15和IL-10的刺激以及G-CSF、MCP-3（CCL7）和IL-22的抑制。在严重的SARS-CoV-2感染中，T细胞凋亡和耗竭与外周CD8+T细胞上PD-1和TIM-3等耗竭标志的过度表达相关。与此类似，8个月后出现PASC症状的个体中也观察到PD-1和TIM-3表达的上调。白介素-27是一种多功能细胞因子，诱导NFIL3轴的激活，导致TIM-PD-L1和IL-10的上调表达，可以直接促进T细胞耗竭，导致有效清除慢性病毒感染的能力受损。因此，针对上游IL-27信号通路以缓解或逆转CD8+T细胞耗竭是减轻长期COVID不良结果的可行策略。此外，已经发现IL-27信号通路参与代谢重编程，具体通过上调UCPPPAR⍺和PCC-1⍺来增加能量消耗和激活热产生。面板中其他参与能量代谢的分子包括氨基己二酸（已建立为糖尿病的预测因子）、牛磺酸和酰基肉碱。亚精胺以其抗氧化、抗炎作用以及促进一氧化氮产生以改善线粒体功能和生物合成的能力而闻名，而离子性二甲基精氨酸则产生相反的效果。康复期牛磺酸途径的抑制与健康相关生命质量较差和不良结果相关。有趣的是，牛磺酸已被证明可以缓解氧化应激、促进有益代谢效应，并保护心血管系统。在各种动物模型中，牛磺酸给予改善了力量、消除行为、记忆和衰老的其他标志，通过减轻细胞衰老、线粒体功能障碍、DNA损伤和慢性炎症。然而，在人体中，关于牛磺酸补充剂缓解PASC症状的长期安全性和有效性仍有待确定。总的来说，这些数据表明，持续改变的细胞生物能量和线粒体功能障碍构成了发展PASC的重要风险因素，可以通过靶向这些因素来改善临床结果。

鉴于目前对长期COVID缺乏经验证明的有效治疗方案，我们的研究结果指出了几个可能在未来研究中探索的途径。首先，持续的免疫激活可能会影响伤口愈合并造成神经炎症。因此，可以探索抗炎策略，如单克隆抗体阻断IL-TNF和IL-1受体或短期皮质类固醇，因为它们在急性SARS-CoV-2感染中已经被应用。其次，由于观察到血小板脱颗粒和凝血过程异常，长期COVID患者中存在较高血栓栓塞风险的个体可能会受益于抗凝治疗。第三，全局代谢组学分析显示了蛋氨酸代谢和三羧酸循环中特定的改变，这提示抗氧化剂和治疗策略可能在支持线粒体功能和能量产生方面发挥作用。第四，牛磺酸补充可能根据牛磺酸水平与PASC症状和生活质量之间的强烈和一致的相关性，缓解长期COVID的负担。最后，观察到的TMAO和苯乙酰谷氨酰胺等肠道菌群源性代谢物的失调，以及长期COVID中肠道菌群失调的发现，代表着一个有吸引力的治疗目标。

研究局限性

我们的研究采用了一种综合系统的方法来研究PASC，但仍存在一些限制。由于我们的研究代表了一个相对严重的疾病队列，在大规模疫苗接种之前需要住院治疗，所以我们的发现应该推广到在家康复和已接种疫苗的受试者中。事实上，新出现的证据表明，对SARS-CoV-2的疫苗接种可能能够保护先前感染的受试者免受PASC症状的影响。这可能与它们刺激抗刺突蛋白抗体产生和T细胞激活以促进病毒清除和缓解慢性炎症的能力有关。此外，Omicron变异体的出现显著增加了传播性，但病情和致病性减弱。然而，由于感染Omicron变异体的人数增加，全球范围内更多人出现了长期COVID症状。此外，尽管我们采用了早晨的血液采集来最小化日内变化，但代谢谱及其与自我报告的PASC症状的关系可能会受参与者禁食状态的干扰。有必要进行大规模前瞻性队列的未来研究，以验证在长期COVID病理生理学中所涉及的生物标志物和分子途径，并评估几种已确定的治疗靶点在临床试验中的功效。